Coronavirüs replikasyon-transkripsiyon kompleksi: NiRAN-RdRp alt birimlerinin nsp9'daki korunmuş bölgelere önemli ve seçici NMPilasyonu

Peter Sarnow, Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi, Stanford Üniversitesi, California tarafından düzenlenmiştir, 25 Aralık 2020'de onaylanmıştır (25 Ekim 2020'de gözden geçirilmiştir)

Çoğaltma ve evrimsel koruma için gerekli olan koronavirüslerin transkripsiyon komplekslerinin replikasyonunda alt birimler arasındaki etkileşimi rapor ediyoruz.Nsp12 ile ilişkili NiRAN alanının transta nükleosid monofosfat (NMP) transferaz aktivitesine sahip olduğuna dair kanıt sağladık ve hedefi olarak nsp9'u (bir RNA bağlayıcı protein) tanımladık.NiRAN, Mn2+ iyonlarına ve bitişik korunmuş Asn kalıntılarına dayanan bir reaksiyonda NMP kısmının korunmuş nsp9 amino terminaline kovalent bağlanmasını katalize eder.NiRAN aktivitesinin ve nsp9 NMPilasyonunun koronavirüs replikasyonu için gerekli olduğu bulundu.Veriler, yuvalanmış virüs enzim işaretçisinin bu aktivitesini, bir RNA virüsleri sınıfında RNA sentezinin başlatılmasının işlevsel ve evrimsel olarak tutarlı olduğu hipotezindeki önceki gözlemlere bağlamamızı sağlar.

Nidovirales'in (Coronaviridae, Arterioviridae ve diğer 12 aile) RNA'ya bağımlı RNA polimerazı (RdRps), NiRAN adı verilen poliproteinden salınan yapısal olmayan proteindeki (nsp) amino terminal (N-terminal) alanına bağlıdır. 1ab viral ana proteazdan (Mpro) oluşur.Daha önce, arteriyel virüs NiRAN-RdRp nsp'nin kendi GMPilasyon/UMPilasyon aktivitesi rapor edilmişti ve nükleosid monofosfatın (NMP) (şu anda bilinmeyen) virüs ve/veya hücre biyopolimerizasyon Şeylerine transferi için bir geçici oluşturması önerilmişti.Burada, koronavirüsün (İnsan Coronavirüsü [HCoV]-229E ve Şiddetli Akut Solunum Sendromu Coronavirüs 2) nsp12'nin (NiRAN-RdRp), Mpro aracılı nsp9 oluşumu yoluyla nsp9'dan türetilen Mn2+ bağımlı NMPilasyon aktivitesine sahip olduğunu gösteriyoruz. N-terminali yan nsp'leri proteolitik olarak serbest bırakılır, fosforamidat, nsp9'un N-terminalindeki birincil amine (N3825) bağlanır.Bu reaksiyonda tercih edilen nükleotid üridin trifosfattır, ancak adenozin trifosfat, guanozin trifosfat ve sitidin trifosfat da uygun ko-substratlardır.Rekombinant koronavirüs nsp9 ve nsp12 proteinleri ve genetiği değiştirilmiş HCoV-229E mutantlarının kullanıldığı mutasyon çalışmaları, hücre kültüründe NiRAN aracılı nsp9 NMPilasyonu ve virüs replikasyonu için gerekli kalıntıları belirledi.Veriler, NiRAN aktif bölge kalıntılarının tahminini doğruladı ve nsp9 N3826 kalıntılarının, nsp9 NMPilasyonu ve in vitro virüs replikasyonundaki önemli rolünü belirledi.Bu kalıntı, korunmuş N-terminal NNE tripeptit dizisinin bir parçasıdır ve koronavirüs ailesindeki nsp9 ve onun homologlarının tek değişmez kalıntısı olduğu kanıtlanmıştır.Bu çalışma, diğer iç içe geçmiş virüslerin NMPilasyon aktivitesinin fonksiyonel çalışması için sağlam bir temel sağlar ve antiviral ilaçların geliştirilmesi için olası hedefler önerir.

Nidovirales pozitif sarmallı RNA virüsü çeşitli omurgalıları ve omurgasızları enfekte eder (1, 2).Sıralama şu anda 14 aileyi (3) içeriyor ve bunların arasında Coronavirüs ailesi son 20 yılda kapsamlı bir şekilde inceleniyor.O zamanlar, hayvan konakçılarından üç zoonotik koronavirüs ortaya çıktı ve insanlarda ciddi solunum yolu enfeksiyonlarının büyük ölçekli salgınlarına neden oldu.Şiddetli akut bulaşıcı hastalıkların neden olduğu kalıcı pandemiler dahil.Solunum Sendromu Coronavirüs 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirüsler ortak bir genom organizasyonunu paylaşır ve membrana bağlı replikasyon-transkripsiyon kompleksinin (RTC) alt birimi, 5-β² terminalinin üçte ikisinde ve virüs partikülünün ana yapısal alt biriminde ve ayrıca bazı aksesuarlarda kodlanır. .Genomun 3??² uç üçte birinde kodlanan protein (1).Planarian virüslerin bir ailesi (Monoviridae) (8) dışında, tüm yuvalanmış virüsler, genomik RNA'dan çevrilen iki büyük açık okuma çerçevesinde (ORF) ORF1a ve ORF1b'de RTC alt birimlerini kodlar.ORF1a, poliprotein (pp) 1a'yı kodlar ve ORF1a ve ORF1b, pp1ab'yi ortaklaşa kodlar.ORF1a tarafından kodlanan ana proteazın (Mpro) genel katılımıyla, hem pp1a hem de pp1ab, pikornavirüsün 3Cpro'su ile homolojiye sahip olduğundan, 3CLpro olarak da bilinen çeşitli yapısal olmayan proteinlere (nsps) proteolitik olarak işlenir ( 9).Bu nsp'lerin büyük bir dinamik RTC halinde bir araya getirildiği, genomik RNA'nın (replikasyon) ve bir dizi subgenomik RNA'nın (transkripsiyon) sentezini katalize ettiği ve ORF1b'nin (10???) aşağı akışında bulunan ORF'nin ekspresyonunu koordine etmek için kullanıldığı düşünülmektedir. ?12).

Çekirdek RTC, RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRp) (13), süper aile 1 helikaz (HEL1) (14, 15) ve esas olarak ORF1b ve koronavirüs ailesinde kodlanan çeşitli RNA işleme enzimlerini içerir. Arterioviridae ailesinde nsp9-nsp12 (bkz. referans 10ââ 12).RdRp ve HEL1, kuş yuvası virüsünün iki (beşte bir) korunmuş alanını temsil eder ve diğer RNA virüsleri arasında homolojiye sahiptir.Çekirdek replikazın, Mpro'nun (sırasıyla koronavirüs nsp5 ve arteriyel virüs nsp4) aşağı akışında, pp1a'nın karboksi terminali (C-terminal) bölgesinden salınan birkaç küçük nsp dahil olmak üzere diğer alt birimler tarafından desteklendiğine inanılmaktadır.Sınırlı aileye özel korumaya ve çeşitli faaliyetlere sahiptirler (referans 10ââ12'de incelenmiştir).

Nispeten yakın zamanda, tüm yuvalanmış virüslerde RdRp'ye bitişik amino terminalinde (N-terminal) benzersiz sekans motifi özelliklerine sahip bir alan bulundu, ancak başka RNA virüslerinde bulunmadı (16).Konumuna ve nükleotid transferaz (nükleosid monofosfat [NMP] transferaz) aktivitesine bağlı olarak bu alan, NiRAN (Nestvirus RdRp ile ilişkili nükleotid transferaz) olarak adlandırılır.NiRAN-RdRp'nin çift alanlı kombinasyonu, Coronaviridae ailesinde nsp12'yi ve Arterioviridae ailesinde nsp9'u oluşturur ve diğer Nestoviridae'de NiRAN-RdRp'nin viral poliproteinden bağımsız bir nsp olarak salınması beklenir.Coronavirüste NiRAN alanı ??1/450 kalıntı içerir ve bağlayıcı bölge (16?19) aracılığıyla C-terminal RdRp alanına bağlanır.At Arterit Virüsünde (EAV) (Arteriviridae), rekombinant nsp9, Nestovirüs, AN, BN ve CN'deki üç korunmuş dizi bazına bağlı olan Mn2+ iyonuna bağlı (kendi) UMPilasyon ve GMPilasyon aktivitelerini gösterir. Dizideki kalıntılar.N, NiRAN'ı temsil eder) (16).Bu motiflerin N-terminal kenarları, AN öncesi daha az koruyucu bir motiftir.Bu kalıntıların bazıları aynı zamanda uzaktan ilişkili protein kinazlarda da korunur; burada bunların nükleosid trifosfat (NTP) bağlanması ve katalitik aktiviteye dahil oldukları gösterilmiştir (20, 21).Bu gözlemle tutarlı olarak, Pseudomonas syringae'den gelen psödokinaz SelO'daki birkaç önemli aktif bölge kalıntısı, yakın zamanda yayınlanan SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 süper kompleksi ile birleştirilebilir.Elektron mikro yapısında üst üste bindirilmiş korunmuş Coronavirüs NiRAN kalıntıları.Rekombinant protein (17).Belgelenen (kendi kendine) U/GMPilasyonun, NMP'yi (şu anda bilinmeyen) substrata (16) aktarmak için geçici bir durum oluşturacağı ve NiRAN ile protein kinaz (17, 19) arasındaki yapısal benzerliğin olduğu tahmin edilmektedir. NiRAN diğer proteinleri değiştirir.

Yuvalanmış virüslerle benzersiz ve benzersiz sistematik ilişkisi ve RdRp'den genetik ayrılması da dahil olmak üzere birçok özellik, NiRAN'ı yuvalanmış virüsler için makul bir anahtar düzenleyici enzim haline getirir ve bu da bunların ortaya çıkması ve kimliği açısından kritik öneme sahiptir.Daha önce, genom/subgenomik translasyonu veya replikasyon/transkripsiyonu düzenlemek için NiRAN'ı içeren üç olası fonksiyon çağrılmıştı.O dönemde mevcut olan kıt ve eksik veriler göz önüne alındığında, her fonksiyonun kendine göre avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır (16).Bu araştırmada, iki cinsi temsil eden koronavirüslerin biyokimyasal ve ters genetik çalışmalarını birleştirmeyi ve bulgularımızı, bu Gizemli alemin iç yüzünü anlamak için koronavirüs ailesinin doğal mutasyonunun evrimsel arka planına koymayı amaçlıyoruz.RTC'deki doğal hedeflerin tanımlanması yoluyla NiRAN'ın anlaşılmasındaki büyük ilerlemeleri rapor ediyoruz; bu (mevcut üç hipotez arasında), bu alanın yuvalanmış virüs RNA'sının sentezini başlatmadaki rolüne katkıda bulunur.Bu araştırma aynı zamanda NiRAN'ın virüs ana bilgisayar arayüzündeki diğer rolleri için de olasılıkların önünü açıyor.

Korona virüsü nsp12 ile ilişkili NiRAN alanının enzimatik özelliklerini karakterize etmek için, E. coli'de insan koronavirüsü 229E (HCoV-229E) nsp12'nin C terminalinde bir His6 etiketi bulunan rekombinant bir formunu ürettik ve bunları birleştirdik. [a32-P] içeren protein Malzemeler ve Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi MnCl2 varlığında NTP ile birlikte inkübe edin.Reaksiyon ürününün analizi, nsp12 (106 kDa) ile birlikte göç eden radyo-etiketli bir proteinin varlığını gösterdi; bu, koronavirüs nsp12'nin, tercihen üridin monofosfat (UMP) (Şekil 1A) ile oluşturulan kovalent protein-NMP eklentilerinin oluşumunu katalize ettiğini gösterir. B).Kantitatif analiz, diğer nükleotidlerle karşılaştırıldığında UMP katılımının sinyal yoğunluğunun 2 ila 3 kat arttığını gösterdi (Şekil 1C).Bu veriler, koronavirüsün NiRAN alanının tahmin edilen NMP transferaz aktivitesiyle tutarlıdır (16), ancak koronavirüsün ve arteriyel virüsün NiRAN alanının nükleotit tercihlerinin farklı olduğunu gösterir.

HCoV-229E nsp12'nin kendi kendine NMPilasyon aktivitesi.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa), belirlenen [a-32P] NTP ile 6 mM MnCl2 varlığında 30 dakika boyunca inkübe edildi (ayrıntılar için Malzemeler ve Yöntemlere bakın).Reaksiyon ürünleri SDS-PAGE ile ayrıldı ve Coomassie parlak mavisi ile boyandı.(B) Radyo-etiketli protein fosfor görüntüleme ile görselleştirilir.Nsp12-His6 ve protein moleküler kütle işaretleyicilerinin (kilodalton cinsinden) pozisyonları A ve B'de gösterilmektedir. (C) Radyoaktif sinyalin yoğunluğu (ortalama ± SEM), üç bağımsız deneyden belirlendi.*P≤0.05.Sinyal gücü (yüzde) UTP ile ilgilidir.

NiRAN ile ilişkili enzim aktivitelerinin, EAV ve SARS-CoV'nin hücre kültüründe replikasyonu için gerekli olduğu gösterilmiş olsa da (16), spesifik NiRAN fonksiyonu ve potansiyel hedefler henüz belirlenmemiştir.NiRAN ile protein kinaz benzeri kıvrımlara sahip bir protein ailesi (17, 22) arasında yakın zamanda bildirilen yapısal benzerlik, bizi NiRAN'ın diğer proteinlerin NMPilasyonunu katalize ettiği hipotezini test etmeye yöneltti.HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) tarafından kodlanan yapısal olmayan proteinler de dahil olmak üzere, her biri bir C-terminali His6 etiketi (SI ek, Tablo S1) içeren bir dizi potansiyel homolog hedef oluşturduk ve bu proteinleri, nsp12 varlığında veya yokluğunda [a32-P] üridin trifosfat ([a32-P]UTP) ile inkübe edin.E. coli'de üretilen sığır serum albümini ve MBP-LacZα füzyon proteini, kontrol olarak görev yaptı (Şekil 2A, şerit 1 ila 7).Radyo-etiketli protein, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve otoradyografi ile analiz edildi ve nsp12 ve nsp9 içeren reaksiyonda güçlü bir radyoaktif sinyal olduğu bulundu.Sinyalin konumu, nsp9'un nsp12 aracılı UMPilasyonunu gösteren nsp9'un moleküler kütlesine karşılık gelir (Şekil 2B, parça 7).UMPillenmiş başka test proteini bulunmadı, bu da bizi nsp9'un nsp12'nin spesifik bir substratı olduğu sonucuna götürdü.Şekil 1'de gösterilen kendi kendine NMPilasyon verileriyle tutarlı olarak nsp12, verimliliği farklı olmasına rağmen dört NMP'nin tamamını nsp9'a aktarabilmektedir, UMP> adenozin monofosfat (AMP)> guanozin monofosfat (GMP)> sitidin monofosfat (CMP) ) ( Resim).3A ve B).Bu tahlilde kullanılan koşullar altında (reaksiyon ve maruz kalma süresini kısaltın, nsp12 konsantrasyonunu azaltın; malzemeler ve yöntemler), nsp12'nin kendi kendine NMPilasyonu tespit edilemedi (Şekil 2B, şerit 7 ve Şekil 1B'yi karşılaştırın). etkili (ve birden fazla tur) UMP'nin nsp12'den nsp9'a geçtiğini kanıtladı.UMP transferaz aktivitesi, Şekil 3C'de gösterildiği gibi Mn2+ iyonlarının varlığını gerektirirken, Mg2+ varlığında yalnızca minimal UMP transferaz aktivitesi gözlendi ve test edilen diğer iki iki değerlikli katyonun varlığında hiçbir aktivite gözlenmedi.Benzer veriler, sitidin trifosfat (CTP), guanozin trifosfat (GTP) ve adenozin trifosfat (ATP) içeren NMPilasyon analizlerinde de elde edildi (SI ek, Şekil S1).

Nsp9'un HCoV-229E nsp12 aracılı UMPilasyonu.HCoV-229E nsp12-His6⁺ aracılı UMPilasyon aktivitesini değerlendirmek için bir dizi protein substratı (sığır serum albümini, MBP-lacZα ve ORF1a tarafından kodlanan C-terminal His6 ile etiketlenmiş bir dizi HCoV-229E nsps dahil) kullanıldı protein.Malzemeler ve yöntemlerde açıklandığı gibi proteini [a-32P] UTP ile 10 dakika boyunca nsp12'nin yokluğunda (A) veya varlığında (B) inkübe edin.A ve B'nin üst kısmında Coomassie Brilliant Blue ile boyanmış SDS-poliakrilamid jel gösterilir ve A ve B'nin alt kısmında karşılık gelen otoradyogramlar gösterilir.Protein moleküler kütle işaretleyicisinin konumu (kilodalton cinsinden) solda verilmiştir.Nsp12-His6'nın (B, üst) konumu ve nsp12-His6'nın nsp9-His6 (B, şerit 7) ile inkübasyonu sırasında gözlemlenen radyoaktif sinyal de belirtilir; bu, [a-32P]UMP'nin nsp9-His6'ya olduğunu gösterir. (12,9 kDa), test edilen diğer proteinler için gözlemlenmemiştir.

Nsp9 NMPilasyonunun HCoV-229E NiRAN aracılı biyokimyasal ve virolojik karakterizasyonu.(A ve B) Reaksiyonda kullanılan nükleotid ortak substratının rolü.Nsp12-His6 ve nsp9-His6 karıştırılır ve standart NMPilasyon testinde farklı [a-32P] NTP'lerin varlığında inkübe edilir.(A, üst) Coomassie lekeli nsp9-His6, SDS-PAGE ile ayrılmış.(A, alt) Jelin aynı alanının otoradyografisi.(B) Belirlenen nükleotid kofaktörün varlığında göreceli aktivite (ortalama ± SEM), üç bağımsız deneyden belirlenir.*P≤0.05.(C) Metal iyonlarının rolü.Her biri 1 mM konsantrasyona sahip [α-32P] UTP ve farklı metal iyonlarının varlığında standart NMPilasyon testi gösterilmektedir.C'de üstte Coomassie boyalı nsp9-His6 gösterilir ve C'de altta karşılık gelen otoradyografi gösterilir.Etiketli proteinin boyutu (kilodalton cinsinden) A ve C'nin solunda gösterilmektedir. (D) Belirtilen amino asit ikamesini taşıyan HCoV-229E nsp12-His6'nın mutant formu, açıklandığı gibi [a-32P]UTP'dedir. Malzemeler ve Yöntemler bölümünde.NMPilasyon reaksiyonunda üretilen radyo-etiketli nsp9-His6, fosforilasyon görüntüleme (D, üst) ile tespit edilir.Yabani tip (ağırlık) proteinle karşılaştırıldığında göreceli aktivite D'de gösterilir ve alt kısım, üç Bağımsız deneyden elde edilen ortalama (±SEM) olarak alınır.Yıldız işaretleri korunmamış kalıntıların ikamelerini gösterir.(E) Enfeksiyondan 24 saat sonra elde edilen pl hücrelerinin kültür süpernatanındaki virüs titresi plak tahlili ile belirlendi.Tasarlanmış HCoV-229E mutantının NiRAN alanındaki kodon ikameleri belirtilmiştir (kalıntı numaralandırması bunların pp1ab'deki konumlarına dayanmaktadır).Replikasyon eksikliği olan RdRp aktif bölge mutantı nsp12_DD4823/4AA, kontrol olarak kullanıldı.

NiRAN'ın aktif bölgesini daha derinlemesine anlamak ve nsp9'a özgü NMP transferaz aktivitesiyle ilgili kalıntıları belirlemek için, NiRAN AN, BN ve CN motiflerindeki konservatif kalıntıları değiştirdiğimiz mutasyon analizi gerçekleştirdik ( 16) Ala'dır (SI ek, Şekil S2).Ek olarak, konservatif Arg'dan Lys'e veya Lys'den Arg'a ikamelerin etkisi iki durumda değerlendirildi.Bir (negatif) kontrol olarak, koronavirüslerin ve diğer yuvalanmış virüslerin NiRAN alanında korunmayan veya daha az korunmayan kalıntılar Ala ile değiştirilir. K4116A'nın (ön AN motifinde), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A'nın (motif) değiştirilmesi BN) ve D4280A (CN), nsp12 yoluyla nsp9 NMPilasyonunu önemli ölçüde azaltır veya hatta ortadan kaldırırken, konservatif ikamelere (R4178K), K4116R) sahip proteinler, aktivitelerinin %60 ve %80'ini korur; bu, kendi taraflarındaki kısıtlamaların gevşetildiğini gösterir. zincirler fizikokimyasal olarak hassastır (Şekil 3D).Diğer birçok korunmuş E4145A, D4273A, F4281A ve D4283A kalıntısının değiştirilmesi çok daha az zararlıdır ve nsp9 UMPilasyonu yalnızca orta derecede azalır.Diğer NTP'leri içeren nsp9 NMPilasyon reaksiyonlarında da benzer sonuçlar elde edildi (Şekil 3D ve SI ek, Şekil S3), spesifik amino asit ikameleri üzerinde gözlemlenen etkilerin, kullanılan nükleotit ortak substrat türünden bağımsız olduğunu doğruladı.Daha sonra, bu nsp12 ikamelerinin hücre kültüründe koronavirüslerin replikasyonu üzerindeki olası etkisini test ettik.Bu amaçla, 5-7 hücrenin transkripsiyonunu yapmak için rekombinant aşı virüsüne (23, 24) klonlanmış, genetik olarak tasarlanmış uygun tamamlayıcı DNA (cDNA) şablonlarını kullandık.Bu hücrelerde üretilen bulaşıcı virüs soyunun titrasyonu, çoğu HCoV-229E NiRAN mutantının mümkün olmadığını gösterdi (Şekil 3E).Canlı olmayan viral mutantlardan oluşan bir grup, in vitro NMP transferaz aktivitesini ortadan kaldırdığı veya önemli ölçüde azalttığı gösterilen alternatifleri içerir (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ancak iki alternatif daha vardır (K4116R, E4145A)80 % rezerve?Bunların in vitro NMPilasyon aktiviteleri, ilave kısıtlamaların söz konusu olduğunu göstermektedir.Benzer şekilde, NiRAN'ın in vitro NMPilasyon aktivitesinde orta derecede bir azalmaya neden olan diğer iki mutasyon (R4178K, F4281A) canlı virüsler üretti, ancak bu virüsler, replikasyon yoluyla titreleri önemli ölçüde azalttı.Şekil 3D'de gösterilen in vitro aktivite verileriyle tutarlı olarak, koronavirüs ve/veya diğer yuvalanmış virüslerde korunmayan diğer dört kalıntının (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) değiştirilmesi, canlı virüsler üretti. vahşi tip virüse kıyasla orta derecede azaltılmış bir titre (Şekil 3E).

NiRAN aracılı NMP transferaz aktivitesinin aktif RdRp alanına bağlı olup olmadığını araştırmak için, RdRp motif C'deki iki değerlikli metal iyonlarının (11) koordinasyonunda yer alan iki korunmuş Asp kalıntısı, Ala ile değiştirildi. Ortaya çıkan protein nsp12_DD4823/4AA, korunur nsp9 NMPilasyon aktivitesi, nsp12 aracılı in vitro nsp9 NMPilasyon aktivitesinin polimeraz aktivitesi gerektirmediğini gösterir (SI Ek, Şekil S4).

Nsp12 için nsp9'a özgü NMP transferaz aktivitesini belirledikten sonra, NMP-nsp9 eklentisini kütle spektrometresi (MS) ile karakterize etmeye çalıştık.Rekombinant HCoV-229E nsp9'un tam protein kütle spektrumu, 12.045 Da'da bir zirve gösterdi (Şekil 4A).Nsp12'nin eklenmesi, nsp9'un kalitesini değiştirmedi; bu, nsp12 ve nsp9'un, kullanılan koşullar (denatürasyon) altında stabil bir kompleks oluşturamayacağını gösterir (Şekil 4A).UTP ve GTP varlığında, sırasıyla nsp9 ve nsp12 içeren reaksiyonun kütle ölçümü, UTP'nin protein kütlesinin 306 Da hareket ettiğini ve GTP'nin protein kütlesinin 345 Da hareket ettiğini gösterdi; bu, her nsp9 molekülünün bir UMP veya GMP'ye bağlandığını gösterir. (Resim 4) C ve D).NiRAN aracılı nsp9 NMPilasyonu için gereken enerjinin NTP hidrolizi ve pirofosfat salınımından geldiği tahmin edilmektedir.Bu reaksiyonda nsp12'den (enzim) 10 kat daha fazla molar nsp9 (hedef) kullanılmasına rağmen, nsp9'un neredeyse tam NMPilasyonu gözlemlendi; bu, nsp12 ile nsp9 arasındaki etkileşimin kısa ömürlü olduğunu ve nsp12'nin daha fazla nsp9'u NMPilleyebileceğini gösteriyor in vitro molekül.

Nsp12 ve UTP veya GTP varlığında nsp9'un tek NMPilasyonu.HCoV-229E nsp9'un ayrıştırılmış tam protein kütle spektrumu gösterilmektedir (SI ek, Tablo S1) (AD).(A) tek başına nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) UTP varlığında nsp9 + nsp12-His6, (D) GTP varlığında nsp9 + nsp12-His6.

Nsp12 tarafından UMPillenmiş nsp9 kalıntılarını belirlemek için nsp9-UMP, trypsin ile yarıldı.Ortaya çıkan peptitler nano-yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile ayrıldı ve çevrimiçi tandem kütle spektrometresi (MS/MS) ile analiz edildi.Byonic yazılım paketi (Protein Metrics) kullanılarak yapılan veri analizi, N-terminal amino asidin UMPilasyonunu gösterdi.Bu manuel olarak onaylanır.Öncü peptit [UMP]NNEIMPGK'nin tandem kütle spektrumu (SI ek, Şekil S5A), 421 m/z'de bir fragmanı ortaya çıkardı; bu, UMP'nin nsp9'un 1. kalıntısına bağlandığını gösterir.

Nsp9'un N terminalinde Asn, Orthocoronavirinae üyeleri arasında korunur (SI ek, Şekil S6).N-terminal birincil amin nitrojeninin UMP için en olası alıcı olduğuna inanmamıza rağmen, N-terminalinde NMP bağlanmasına ilişkin ek kanıtlar elde etmeye karar verdik.Bu nedenle, HPLC ile saflaştırılan NMPillenmemiş ve NMPillenmiş N-terminal peptidi nsp9, aseton ve sodyum siyanoborohidrit varlığında türetildi.Bu koşullar altında yalnızca serbest birincil aminler propil (25) ile modifiye edilebilir.NNEIMPGK sekansına sahip N-terminal nsp9'dan türetilmiş peptit, biri Asn'nin N-terminalinde ve diğeri C-terminalinde Lys'in yan zincirinde olmak üzere iki birincil amin içerir.Bu nedenle propil grupları her iki uçtan da eklenebilir.NMPillenmemiş peptidlerin ekstrakte edilmiş iyon kromatogramları SI ekinde, Şekil S5B'de gösterilmektedir.Beklendiği gibi, N-terminal ve C-terminal (mono)propile edilmiş (SI ek, Şekil S5B, üst şerit) ve dipropillenmiş peptidler (SI ek, Şekil S5B, alt şerit) tanımlanabilir.Bu model, nsp9'un NMPillenmiş N-terminal peptidinin kullanılmasıyla değişir.Bu durumda yalnızca C-terminali propillenmiş peptitler tanımlanabilir, ancak N-terminal propillenmiş peptitler ve dipropillenmiş peptitler tanımlanmaz (SI Ek, Şekil S5C), bu da UMP'nin N-terminal birincil amine aktarıldığını gösterir. grubun değişiklik yapmasını engelleyin.

Daha sonra hedefe özgü kısıtlamaları tanımlamak için nsp9'un N terminalindeki korunmuş kalıntıları değiştiririz (Ala veya Ser ile) veya sileriz.NiRAN'ın, nsp9'un N-terminal kalıntısının birincil amini ile bir nsp9-NMP eklentisi oluşturduğunu gösteren MS verilerimize dayanarak, nsp9 NMPilasyonunun, nsp9 N-terminalini serbest bırakmak için viral ana proteazı (Mpro, nsp5) gerektirdiğini varsaydık. onun poliprotein öncüsüdür.Bu hipotezi test etmek için E. coli'de nsp9 içeren bir öncü protein nsp7-11 ürettik ve [a-32P] UTP (materyaller ve yöntemler) varlığında standart bir NMPilasyon testi gerçekleştirdik.Şekil 5A'da (şerit 3) gösterildiği gibi kesilmemiş nsp7-11 öncüsü, nsp12 ile radyo-etiketli değildir.Buna karşılık, eğer nsp7-11, öncüden nsp9'u (ve diğer nsp'leri) serbest bırakmak üzere rekombinant nsp5 tarafından kesilirse, nsp9 ile göç eden radyo-etiketli bir protein tespit edilir; bu, kovalent nsp9-NMP eklentilerinin NiRAN ve N-Seçici oluşumunun olduğu sonucumuzu doğrular. .N-terminal Asn'nin terminal birincil amini (pp1a/pp1ab'de konum 3825).Bu sonuç, N-terminalinde bir veya iki ilave kalıntı içeren nsp9 yapısının kullanıldığı deneylerle de desteklenmektedir.Her iki durumda da, nsp9'un NiRAN aracılı UMPilasyonu kaldırıldı (SI Ek, Şekil S7).Daha sonra, nsp9'un N-terminalindeki 3825-NNEIMPK-3832 peptid dizisinden silinmiş bir veya iki Asn kalıntısına sahip bir protein ürettik.Her iki durumda da, nsp9 UMPilasyonu tamamen bloke edildi (Şekil 5B), bu da gerçek nsp9 N-terminalinin bir NMP reseptörü olarak görev yaptığına dair ek kanıt sağladı.

Nsp9'un proteolitik işlenmesi ve nsp12 aracılı UMPilasyonda N-terminal kalıntılarının rolü.(A) nsp9 UMPilasyonu, boş bir nsp9 N-terminali gerektirir.Nsp7-11-His6, rekombinant Mpro'nun (nsp5-His6) varlığında veya yokluğunda UTP içeren NMPilasyon saptama tamponunda 30 °C'de önceden inkübe edilir.3 saat sonra Malzemeler ve Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi nsp12-His6'yı ekleyerek NMPilasyon testini başlatın.Nsp5-His6 (şerit 1) ve nsp9-His6 (şerit 2) içeren reaksiyon kontrol olarak kullanıldı.10 dakika sonra reaksiyon sonlandırıldı ve reaksiyon karışımı, SDS-PAGE ile ayrıldı.Protein Coomassie Brilliant Blue (A, üst) ile boyandı.Nsp7-11-His6 öncüsü ve nsp5-His6 aracılı bölünmeden kaynaklanan işlenmiş ürün sağda gösterilmektedir.Lütfen (küçük boyutları nedeniyle) nsp7 ve nsp11-His6'nın bu jelde tespit edilemediğini ve reaksiyonun nsp5-His6 (şerit 1 ve 4; nsp5-His6'nın konumu içi dolu bir daire ile gösterilir) ile desteklendiğini unutmayın. veya nsp9-His6 (Şerit 2), MBP füzyon proteinleri olarak ifade edildikleri için artık safsızlıklar olarak az miktarda MBP (açık dairelerle gösterilir) içerir (SI ek, Tablo S1).(B) Nsp9-His6 varyantında bir veya iki N-terminal Asn kalıntısı yoktur (pp1a/pp1ab'deki konuma göre kalıntı numaralandırması) ve nsp12-His6 ve [a-32P] UTP ile saflaştırılır ve inkübe edilir.B, Coomassie ile boyanmış SDS-PAGE üstte gösterilir, B, ilgili otoradyograf altta gösterilir.Moleküler ağırlık işaretleyicisinin konumu (kilodalton cinsinden) solda gösterilmiştir.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminalinde korunan kalıntılar, Ala veya Ser ile değiştirildi ve nsp12-His6 aracılı UMPilasyon reaksiyonunda aynı miktarda protein kullanıldı.Reaksiyon ürünleri SDS-PAGE ile ayrıldı ve Coomassie Brilliant Blue (C, üst) ile boyandı ve radyo-etiketli nsp9-His6, fosforesans görüntüleme (C, orta) ile tespit edildi.Yabani tip (ağırlık) proteini referans olarak (%100'e ayarlanmış) kullanarak, göreceli NMPilasyon aktivitesi (ortalama ± SEM), üç bağımsız deneyden hesaplandı.(D) HCoV-229E vahşi tip Huh-7 hücreleri ile enfekte edilmiş Huh-7 hücrelerinin pl hücre kültürü süpernatanındaki virüs titreleri ve nsp9'da belirlenmiş amino asit ikamelerini taşıyan mutantlar, plak tahlili ile belirlendi.Replikasyon eksikliği olan RdRp motifi C çift mutantı DD4823/4AA, negatif kontrol olarak kullanıldı.

Nsp9'un N terminali (özellikle konum 1, 2, 3 ve 6), Orthocoronavirinae alt ailesinin üyeleri arasında oldukça korunmuştur (SI ek, Şekil S6).Bu kalıntıların nsp12 aracılı nsp9 NMPilasyonundaki olası rolünü incelemek için, nsp9'un N-terminalindeki iki ardışık Asn kalıntısı, Ala veya Ser (tek başına veya kombinasyon halinde) ile değiştirildi.Yabani tip nsp9 ile karşılaştırıldığında, N3825'in Ala veya Ser ile değiştirilmesi, nsp12 aracılı UMPilasyonda iki kattan fazla azalmayla sonuçlandı (Şekil 5C).NMPilasyonun, N-terminal kalıntısının yan zinciri yerine N-terminal birincil aminde meydana geldiği yönündeki sonucumuzla tutarlı olarak, N3825A ve N3825S'nin değiştirilmesiyle önemli miktarda artık NMPilasyon gözlemledik.İlginç bir şekilde, eğer ikinci Asn, Ala veya Ser ile değiştirilirse, nsp9 UMPilasyonu daha güçlü bir şekilde (10 kattan fazla) azalırken, Ala'nın 3, 4 ve 6 konumlarındaki değiştirilmesinin nsp9 UMPilasyonu üzerinde yalnızca orta düzeyde bir etkisi vardır (Şekil 2). ).5C).ATP, CTP veya GTP (SI eki, Şekil S8) kullanılarak benzer sonuçlar elde edildi.Toplu olarak bu veriler, N2826'nın (nsp9'da konum 2) nsp9 NMPilasyonundaki anahtar rolünü gösterir.

Nsp9'un N terminali ile NMPilasyon arasındaki fonksiyonel korelasyona dair ek kanıt elde etmek için, Coronavirüs ailesinin nsp9 sekansının (104 ile 113 kalıntı arasında değişen) çoklu sekans hizalamasını (MSA) gerçekleştirdik (SI Ek, Şekil) S6).Toplamda, farklı memelileri, kuşları ve sürüngen konakçıları enfekte eden Orthocoronavirinae alt familyasının 5 cinsinin 47 (bilinen ve varsayılan) türünde, toplamda yalnızca 8 kalıntının değişmez olduğu bulunmuştur.Silmeler ve eklemeler de dahil olmak üzere en kapsamlı değişiklikler, önceki yapısal çalışmalarla belirlendiği üzere nsp9'un ikincil yapı elemanları arasındaki döngülerde gözlemlendi (26 ??28).Nsp9'un C-terminal kısmının β sarmalında ve a sarmalında beş değişmez kalıntı bulundu.Üç değişmez kalıntı, nsp9'un N terminalinin NNE motifini oluşturur.Bu motifin ikinci Asn'sinin, uzak ilişkili kurbağa koronavirüsünün varsayımsal nsp9'u tarafından da paylaşılan tek değişmez kalıntı olduğu ve Alphaletovirus'un Letovirinae alt ailesindeki Microhyla letovirus 1 türünü temsil ettiği ortaya çıktı.Nsp9 ikincil yapı elemanlarındaki kalıntıların korunması, katlanmayı veya bilinen RNA bağlanma özelliklerini korumak için yapısal hususlarla rasyonelleştirilebilir.Ancak bu akıl yürütme NNE'nin korunması için geçerli görünmüyor ve bu çalışmadan önce, tripeptid dizisinin varyasyonunu sınırlayan kısıtlamaların doğası tamamen belirsizdi.

Nsp9-NMPilasyonun ve NNE korumasının koronavirüs replikasyonundaki önemini belirlemek amacıyla, nsp9 N-terminal kalıntılarının tek veya çift substitüsyonunu taşıyan HCoV-229E mutantları ürettik, bu da nsp9 NMPilasyonun in vitro zararlı olduğunu gösteriyor.Başlamadan önce, bu ikamelerin (nsp8|9 bölünme bölgesinin yakınında) C-terminal pp1a bölgesinin proteolitik işlenmesini etkileyip etkilemediği sorusunu yanıtlamaya çalışıyoruz.Nsp9'un N-terminalinde karşılık gelen ikameleri içeren bir dizi nsp7-11 poliprotein yapısı, E. coli'de üretildi ve rekombinant Mpro ile kesildi.Dört bölgenin (nsp9 yan bölgesi dahil) proteolitik bölünmesi, Mpro aracılı nsp8|9 bölünmesine (veya diğer) müdahale eden bu proteinlerdeki yapısal değişiklikler hariç, eklenen herhangi bir ikameden (SI ek, Şekil S9) önemli ölçüde etkilenmez. İnternet sitesi.

Huh-7 hücreleri, nsp9 N terminalindeki korunmuş NNE tripeptidlerindeki (N3825, N3826 ve E3827) Ala veya Ser ikamelerini kodlayan genom uzunluğunda HCoV-229E RNA ile transfekte edildi; bu, mutasyonların çoğunun ölümcül olduğunu gösterdi.N-terminali Asn'nin (N2835A veya N2835S) Ser veya Ala'sını değiştirerek virüsü kurtarmayı başardık, ancak NNE dizisindeki diğer tek ve çift mutasyonlarla (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6AA) virüsü kurtarmayı başaramadık. NN3825/6SS), E3827A) (Şekil 5D).

Bu sonuçlar, koronavirüslerin doku kültüründe replikasyonunun sınırlı (aynı veya benzer) olduğunu, vücuttaki nsp9 NMPilasyon bölgelerinin doğal mutasyonunu sınırladığını ve bu yanıtın koronavirüslerin yaşam döngüsündeki anahtar rolünü desteklediğini göstermektedir.

Son deney grubunda, E. coli'de SARS-CoV-2 nsp12 ve nsp9 etiketli C-terminal His6'yı ve nsp12'nin iki mutant formunu ürettik.NiRAN ve RdRp alanlarındaki aktif bölge kalıntıları sırasıyla Ala'yı kullanmıştır (Şekil 6A ve SI eki, Tablo S2).SARS-CoV-2 nsp12'deki K4465, NiRAN aktivitesi ve HCoV-229E replikasyonu için gerekli olduğu kanıtlanan HCoV-229E'deki K4135'e (SI Ek, Şekil S2) karşılık gelir (Şekil 3D ve E).Bu kalıntı aynı zamanda daha önce NiRAN kendi kendine UMPilasyonu/kendi kendine GMPilasyonu için gerekli olduğu gösterilen arteriyel virüs EAV nsp9 K94 kalıntısına da karşılık gelir (16).Şekil 6B'de gösterildiği gibi SARS-CoV-2 nsp12, substrat olarak nsp9'u kullanan UMP transferaz aktivitesine sahipken, nsp12_K4465A aktif bölge mutantı aktif değildir.RdRp motif C'nin SDD karakteristik dizisindeki çift ikame, UMP transferaz aktivitesini etkilemez (Şekil 6B), bu da RdRp aktivitesinin nsp9 UMPilasyonunda doğrudan bir etkisinin olmadığını gösterir.CTP, GTP ve ATP (SI eki, Şekil S10) kullanılarak benzer veriler elde edildi.Özet olarak bu veriler, NiRAN aracılı nsp9 NMPilasyonunun, ortokoronavirüs alt ailesinin farklı cinslerini temsil eden koronavirüslerde konservatif bir aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir.

nsp9'un SARS-CoV-2 nsp12 aracılı NMPilasyonu.(A) NMPilasyon testinde kullanılan rekombinant proteini gösteren Coomassie boyalı SDS-poliakrilamid jeli.Kontrol olarak SARS-CoV-2 nsp12'nin NiRAN alanında (K4465A) ve RdRp alanında (DD5152/3AA) aktif bölge ikamesine sahip bir mutant protein kullanıldı.Kalıntı numaralandırması pp1ab'daki konuma göre yapılır.(B) nsp12-His6'nın (vahşi tip [ağırlık] ve mutant) substratı olarak nsp9-His6 ve [a-32P]UTP kullanılarak UMPilasyon tespitinin otoradyografisi.Etiketli proteinin moleküler kütlesi (kilodalton cinsinden) solda gösterilmiştir.

NiRAN alanları genellikle Nidovirales'te korunur (16), bu da Nidovirüs replikasyonu için gerekli olan enzimatik reaksiyonları katalize ettiklerini gösterir.Bu çalışmada, koronavirüsün NiRAN alanının, NTP'yi (NTP'den üretilen) virüs replikasyonunda rol oynayan gizemli bir RNA bağlayıcı protein olan nsp9'a (26 ?? 29) aktardığını, bunu doğal bir hedef olarak belirlediğini kanıtlayabildik ve bunu doğal bir hedef olarak belirledik. koronavirüs RTC'nin ortağı.

NiRAN alanı, monofiletik fakat oldukça farklılaşmış Nidovirales düzenindeki tüm ailelerde korunan çok az sayıda kalıntı içeren üç dizi motifini (AN, BN ve CN) paylaşır (8, 16).Son çalışmalar, bunların yapısal olarak büyük ölçüde karakterize edilmemiş, başlangıçta SelO ailesi olarak adlandırılan protein kinaz benzeri protein ailesiyle ilişkili olduğunu göstermiştir (17, 19, 22, 30, 31).SelO ile ilişkili proteinler kinaz kıvrımlarına sahiptir ancak klasik kinazlarda birçok korunmuş aktif bölge kalıntısı yoktur (22, 32).Aktif bölgeye bağlanan ve spesifik etkileşimlerle stabilize edilen ATP moleküllerinin ters yönelimine dayanarak, SelO'nun AMP'yi (fosfat yerine) protein substratına (22) aktardığı varsayıldı ve ardından doğrulandı; diğer bir bakteriyel SelO benzeri protein YdiU ise yakın zamanda UMP'nin farklı protein substratlarının Tyr ve His kalıntılarına kovalent bağlanmasını katalize ettiği gösterilmiştir (33).

Coronavirüs NiRAN alanının varsayılan aktif bölge kalıntılarının tahminini doğrulamak ve genişletmek amacıyla, koronavirüs nsp12 üzerinde mutasyon analizi gerçekleştirmek için biyokimyasal ve ters genetik yöntemler kullandık (Şekil 3D ve E ve SI ek, Şekil S3 ve tablo) S1â S4).Veriler, HCoV-229E K4135, R4178 ve D4280'in Ala ile değiştirilmesinin, hücre kültüründe in vitro NMP transferaz aktivitesini ve virüs replikasyonunu ortadan kaldırdığını göstermektedir (Şekil 3D ve E ve SI ekleri, Şekil S3), bunların NTP γ-fosfattaki varlığını destekler (K4135, R4178) ve aktif bölge metal iyonlarının koordinasyonu (D4280).K4135 (17) pozisyonunu stabilize ettiği tahmin edilen kuş yuvası virüsü aralığında korunmuş Glu'nun E4145A ikamesinin viral replikasyonu ortadan kaldırdığı gösterilmiştir, ancak şaşırtıcı bir şekilde aktivite in vitro NMPilasyon testinde muhafaza edilmiştir (Şekil 3D ve E ve SI eki, Şekil S3 ve Tablolar S1–S4).Benzer bir gözlem, Salmonella typhimurium'un (E130A) (33) YdiU homologunda ilgili ikame uygulandığında da yapılmıştır.Birlikte ele alındığında bu veriler, bu korunmuş kalıntının katalitik işlevinden ziyade düzenleyici işlevini desteklemektedir.

HCoV-229E NiRAN alanındaki (8) Nestovirüs aralığı içindeki korunmuş Phe kalıntısının (F4281A) değiştirilmesi, in vitro NMPilasyon aktivitesinde bir azalmaya ve hücre kültüründe virüs replikasyonunda önemli bir azalmaya neden oldu (Şekil 3D, E ve SI) ek, Şekil S3).Veriler, daha önce gösterilen homolog DFG motifli Phe kalıntısı gibi bu kalıntının önemli düzenleyici işleviyle tutarlıdır.Klasik protein kinazlarda Mg2+ bağlanma halkasının bir parçasıdır ve omurganın birleşmesi ve düzenlenmesine yardımcı olur.??Etkili katalitik aktivite için gereklidir (32, 34).Sırasıyla K4116 kalıntılarının (preAN motifinde) Ala ve Arg ile değiştirilmesi, viral replikasyonu ortadan kaldırdı ve beklendiği gibi, eklenen amino asit yan zincirine bağlı olarak in vitro NMP transferaz aktivitesi üzerinde farklı etkilere sahipti (Şekil 3D ve E ve SI ekleri) , Şekil S3).Fonksiyonel veriler yapısal bilgilerle tutarlı olup bu kalıntının ATP fosfat ile etkileşim kurduğunu göstermektedir (17).Diğer yuvalanmış virüs ailelerinin NiRAN alanında, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116'nın pozisyonu Lys, Arg veya His (8) tarafından işgal edilmiştir; bu durum, bu spesifik kalıntının fonksiyonel kısıtlamasının gevşetildiğini gösterir.D4188A ve D4283A'nın ikamesi, enzim aktivitesini ortadan kaldırır veya güçlü bir şekilde azaltır ve virüs replikasyonunu ortadan kaldırır (Şekil 3).Bu iki kalıntı, iç içe geçmiş virüslerin çoğunda (ancak hepsinde değil) korunur (8), bu da aileye özgü ancak muhtemelen katalitik olmayan önemli bir işlevi gösterir.Coronaviridae veya diğer Nestioviridae ailelerinde (8) korunmayan diğer birkaç Lys ve Asp kalıntısının (K4113A, D4180A, D4197A ve D4273A) Ala ikameleri kontrol olarak kullanıldı.Beklendiği gibi, bazı durumlarda enzim aktivitesinde ve viral replikasyonda hafif bir azalmayla birlikte bu ikameler büyük ölçüde tolere edilebilir (Şekil 3 ve SI eki, Şekil S3).Genel olarak, koronavirüs mutajenez verileri, EAV NiRAN-RdRp'nin (16) kendi GMP ve ters genetik verileriyle oldukça tutarlıdır; burada EAV nsp9 (koronavirüs nsp12 ortolog) kalıntısı K94 (HCoV-229E K4135'e karşılık gelir) önemli fonksiyonlara sahiptir. R124 (R4178'e karşılık gelir), D132 (D4188'e karşılık gelir), D165 (D4280'ye karşılık gelir), F166 (F4281'e karşılık gelir).Ek olarak, HCoV-229E mutajenez verileri, daha önce bildirilen SARS-CoV ters genetik verileriyle (16) tutarlıdır ve bu verilerden genişletilmiştir; karşılık gelen CN motifi Phe-to-Ala mutantı SARS-CoV_nsp12 için gözlemlenenlere çok benzer. fenotip -F219A ve HCoV-229E_F4281A'yı tanımladı (Şekil 3 D ve E ve SI eki, Şekil S3 ve Tablo S1-S4).

UTP ve GTP (kendi kendine NMPilasyon reaksiyonunda) için net bir tercihe sahip olan EAV ortologları (16) ile karşılaştırıldığında, çalışmamız, koronavirüs NiRAN alanının (HCoV-229E ve SARS-CoV-2 ile temsil edilir) etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. UMP için hafif bir tercih olmasına rağmen dört NMP'nin tümü aktarılmıştır (Şekil 1 ve 3).Spesifik NTP yardımcı substratının nispeten düşük özgüllüğü, yakın zamanda rapor edilen SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 süper kompozit yapısıyla tutarlıdır; burada ADP-Mg2+, NiRAN'ın aktif bölgesine bağlanır ancak adenin Kısmı ile bağlanmaz. spesifik etkileşimlerin oluşması (17).Çalışmamızda NMPilasyon reaksiyonunda kullanılan nükleotit tipinin, mutant proteinin aktivitesi üzerinde farklı bir etkisi yoktur (SI Ek, Şekil S3), bu kalıntıların hiçbirinin spesifik bir nükleobazın bağlanmasıyla yakından ilişkili olmadığını gösterir.Coronavirüslerin ve arteriyel virüslerin NiRAN alanlarında gözlemlenen farklı NTP ortak substrat tercihlerinin yapısal temeli ve potansiyel biyolojik önemi henüz araştırılmayı beklemektedir;bunlar doğru olabilir veya ilgili çalışmaların sınırlamalarından kaynaklanıyor olabilir.Şu anda, arteriyel virüs NiRAN alanının potansiyel NMPilatör aktivitesinin (daha önce karakterize edilen kendi kendine NMPilasyon aktivitesi ile karşılaştırıldığında), arteriyel ve koronavirüs arasındaki benzerlik dikkate alındığında farklı bir ortak substrat tercihine sahip olduğu göz ardı edilemez. NiRAN alanı sınırına ulaştı.Sıraya Dayalı Karşılaştırma (16).Kofaktör olarak Mg2+ kullanan psödokinaz SelO ile karşılaştırıldığında, koronavirüs ve arteriyel virüs NiRAN'ın aktivitesi Mn2+'ya bağlıdır (16) (Şekil 3C ve SI eki, Şekil S1).Mn2+ bağımlılığı ve UTP'ye yönelik bariz tercih, protein NMPilatörlerin alışılmadık bir özelliğidir ve hücreleri stres indüksiyonundan korumak için sıkı Mn2+ bağımlı protein şaperon UMPilasyonunu katalize eden Salmonella typhimurium'un YdiU proteininde yakın zamanda doğrulanmıştır. 33).

Coronavirüs NiRAN alanı ile hücresel protein kinazlar (17, 19) arasında yakın zamanda açıklanan yapısal benzerlik, NiRAN'ın NMP'yi bu çalışmada bildirdiğimiz diğer proteinlere kovalent olarak bağlama becerisine ek destek sağlar.Olası NiRAN hedeflerine yönelik araştırmamızı, RTC'nin ORF1b kodlu replikazına doğrudan veya dolaylı olarak yardımcı olduğu bilinen HCoV-229E ORF1a tarafından kodlanan proteinlere odakladık (12, 35).Deneylerimiz nsp9'un etkili ve spesifik NMPilasyonuna ilişkin kesin kanıtlar sağlar (Şekil 2).Hedef protein, enziminkinden (nsp12) 8 ila 10 kat daha yüksek bir molar fazlalıkta kullanılırsa, nsp9'un tamamen (mono)NMPize olduğu doğrulanır (Şekil 4).Nsp12 ve nsp9 arasındaki etkileşimin kısa süreli olduğu ve nsp9 ile (diğer RTC alt birimlerinin yokluğunda) stabil bir kompleks oluşturmayacağı sonucuna vardık.Bu sonuç SARS-CoV proteomu üzerindeki protein etkileşim çalışmaları ile desteklenmektedir (35).MS analizi, nsp9'un N-terminal kalıntısının birincil aminini NMPilasyon bölgesi olarak tanımladı (SI ek, Şekil S5).Fosforamidat bağının ve N-terminal amino grubunun oluşumu, NiRAN aracılı NMPilasyon aktivitesini, Ser, Thr veya Tyr kalıntılarında O-bağlı AMP oluşumunu katalize eden Pseudomonas syringae SelO aracılı AMPilasyon reaksiyonundan ayırır. 22) ve S. typhimurium YdiU, O-bağlı (Tyr ile) ve N-bağlı (His ile) peptid-UMP eklentilerini oluşturur.SelO protein ailesi hakkında mevcut sınırlı bilgi, bu büyük protein ailesinin üyelerinin, peptit-NMP eklentilerinin oluşumunda büyük ölçüde farklılık gösterdiğini göstermektedir.Bu daha fazla çalışmayı hak eden ilginç bir gözlemdir.

Bu çalışmada elde edilen veriler, nsp9'un NMPilasyonunun serbest bir N-terminali gerektirdiğini varsaymamıza yol açtı.Viral replikasyon bağlamında bu, Mpro ve pp1ab'ın aracılık ettiği replikaz poliprotein pp1a'daki nsp8|nsp9 işleme bölgesinin proteolitik bölünmesiyle sağlanacaktır.Çoğu koronavirüste, bu spesifik bölge (HCoV-229E'de VKLQ|NNEI) ile diğer tüm koronavirüs Mpro bölünme bölgeleri arasındaki fark, Asn'nin (Ala, Ser veya Gly gibi başka bir küçük kalıntı yerine) P1â???Konum (36).İlk çalışmalarda elde edilen peptit bölünme verileri, nsp8|nsp9 bölgesinin bölünme verimliliğinin diğer bölgelerinkinden daha düşük olduğunu gösterdi; bu, 1) bu spesifik bölgenin, C-terminalinin zamanında koordineli işlenmesinde düzenleyici bir role sahip olabileceğini gösterir. pp1a bölgesi veya 2)a Özel korunmuş nsp9 N-terminalinin virüs replikasyonundaki rolü (37).Verilerimiz (Şekil 5A), gerçek N-terminal dizisini taşıyan nsp9'un rekombinant formunun, nsp12 tarafından etkili bir şekilde NMPize edildiğini gösterdi.N-terminali yan dizisi, faktör Xa (nsp9-His6; SI eki, Tablo S1) veya Mpro aracılı bölünme (nsp7-11-His6; Şekil 5A ve SI eki, Tablo S1) ile çıkarıldı.Önemli olarak, kesilmemiş nsp9 içeren öncü nsp7-11-His6, nsp12'nin NMPilasyonuna direnç gösterdi; bu, verilerimizle tutarlıdır; bu, nsp9-NMP eklentisinin N-terminal birincil amin yoluyla oluşturulduğunu gösterir (SI ek, Şekil S5) .NiRAN substrat spesifikliğini daha iyi anlamak için daha sonra nsp9'un bitişik N-terminal kalıntılarına odaklandık.Diğer proteinlerin yokluğunda yapısal olarak esnektirler ve nsp9'un etiketlenmemiş formunda tespit edilmelerini engellerler (26 28, 38), bu da onların sınırlı doğal varyasyonuna işaret eder. nsp9 N-terminal fragmanının işlevi.Bu bölgedeki korunmuş kalıntıların Ala ikameleri (Şekil 5C ve D ve SI ek, Şekil S8), N3826'nın in vitro nsp9 NMPilasyonu için gerekli olduğunu, N3825A ve E3827A ikamelerinin NMPilasyonda bir azalmaya yol açtığını, M3829A ve P3830A ikamelerinin ise bunu yapmadığını ortaya koymaktadır. .Açıkça nsp9 NMPilasyonunu etkiler.N-terminal Asn'nin (N3825A, N3825S) ikamesi, nsp9 NMPilasyonu ve hücre kültüründe virüs replikasyonu (Şekil 5C ve D) üzerinde yalnızca orta düzeyde bir etkiye sahip olmasına rağmen, N-terminal 3825-NN dipeptitinden bir Asn kalıntı dizisinin silinmesi Virüsler için öldürücü olduğu kanıtlanmıştır; bu, N terminalindeki başka bir kalıntıdan önce bir Asn kalıntısının, tercihen Asn'nin gerekli olduğunu gösterir; ancak benzer kalıntıların ikamesinin kısmen tolere edilebileceği görülmektedir (Şekil 5B, C ve D).3825-NN dipeptitinin, özellikle de koronavirüs aralığı içindeki korunmuş ve temel N3826 kalıntısının (SI ek, Şekil S6), NiRAN'ın aktif bölgesindeki nsp9 N-terminalinin doğru bağlanmasını ve yönlendirilmesini sağladığı sonucuna vardık.

Tüm alt ailelerin korunmuş Glu'su için Ala'nın (E3827A) ikame edilmesi, in vitro olarak nsp9 NMPilasyonunu korur ancak hücre kültüründeki virüsler için öldürücüdür (Şekil 5C ve D), bu kalıntının örneğin anahtar etkileşimlerde (NMPillenmiş veya değiştirilmemiş) ek işlevini gösterir. ) nsp9 N-terminusu ve virüs replikasyonunda rol oynayan diğer faktörler.Nsp9 mutasyonları, nsp9'un veya herhangi bir komşu nsp'nin proteolitik sürecini etkilememiştir (39) (SI Ek, Şekil S9), bu durum, gözlemlenen çeşitli nsp9 mutasyonlarının ölümcül fenotiplerinin, C proteolitik süreç-terminal pp1a alanının düzensizliğinden kaynaklanmadığını göstermektedir. .

Yukarıdaki veriler, pp1a/pp1ab'daki nsp8|9 bölünme bölgesinin Mpro aracılı tedavisinden sonra, nsp9'un N terminalinin UMPillenebileceğine (veya başka bir NMP ile kısmen değiştirilebileceğine) dair kanıt sağlar.Ek olarak, nsp9'un N-terminalinin mükemmel korunması (koronavirüs ailesindeki tekil ve değişmez Asn kalıntıları dahil) ve bu çalışmada elde edilen ters genetik verileri (Şekil 3E ve 5D), açıklanan nsp9 NMPilasyonunun şu sonuca varmasına neden oldu: biyolojik olarak ilişkilidir ve koronavirüs replikasyonu için gereklidir.Bu modifikasyonun fonksiyonel sonuçları, örneğin daha önce açıklanan (spesifik olmayan) nsp9 (değiştirilmemiş form) RNA bağlanma aktivitesi (2628) ile ilgili olarak araştırılmayı beklemektedir.N-terminal NMPilasyonu ayrıca nsp9'un protein veya RNA substratları ile etkileşimini veya farklı dört seviyeli düzeneklerin oluşumunu da etkileyebilir.Bunlar yapısal çalışmalarda gözlemlenmiş ve özellikle bu modifikasyonun yokluğunda olmasına rağmen işlevsel olarak koronavirüs replikasyonuyla ilişkili olduğu doğrulanmıştır (26-ââ29, 40).

Her ne kadar koronavirüs NiRAN alanının hedef özgüllüğünün hala daha ayrıntılı olarak karakterize edilmesi gerekse de verilerimiz, koronavirüs NiRAN alanının protein hedef özgüllüğünün çok dar olduğunu göstermektedir.Tüm nidovirüs familyalarının NiRAN alanındaki anahtar aktif bölge kalıntılarının (8, 16) korunması, bu proteinlerin korunmuş NMPilatörünün aktivitesini güçlü bir şekilde desteklemesine rağmen, bu alanın substrat bağlama cep kalıntılarının kimliği ve Nidovirales'in farklı ailelerinin amaçları arasında farklılık gösterebilir.Benzer şekilde diğer iç içe geçmiş virüslerin ilgili hedefleri henüz belirlenmemiştir.Bunlar, nsp9 veya diğer proteinlerin uzak ortologları olabilir, çünkü genellikle yuvalanmış virüslerde korunan beş replikaz alanı dışındaki diziler, Mpro ve NiRAN arasındaki genom dizisi de dahil olmak üzere daha az korunur (8). Bunların arasında nsp9, korona virüs.

Ek olarak, şu anda NiRAN alanının ek (hücresel dahil) hedeflere sahip olma olasılığını da göz ardı edemeyiz.Bu durumda, ortaya çıkan bu protein NMPilatörlerdeki (NMPilatörler) (30, 31) bakteriyel homologların "ana düzenleyicilere" sahip gibi göründüğünü belirtmekte fayda var.NMP, çeşitli hücresel proteinlerin aşağı akış aktivitelerini düzenlemek veya ortadan kaldırmak için modüle eder, böylece hücresel stres tepkisi ve redoks homeostazisi gibi çeşitli biyolojik süreçlerde rol oynar (22, 33).

Bu çalışmada (Şekil 2 ve 4 ve SI Ek, Şekil S3 ve S5), nsp12'nin UMP (NMP) kısmını nsp9'da tek bir (korunmuş) pozisyona aktardığını, diğer proteinlerin ise değiştirilmediğini kanıtlayabildik. Kullanılan Koşullar altında, iyi tanımlanmış (gevşek yerine) substrat spesifikliği desteklenir.Bununla tutarlı olarak, N-terminal nsp9 NMPilasyonuyla karşılaştırıldığında, nsp12'nin kendi NMPilasyon aktivitesi çok düşüktür, tespiti daha uzun otoradyografiye maruz kalma süresi gerektirir ve nsp12 konsantrasyonunda 10 kat artış kullanılır.Ek olarak, MS analizimiz nsp12'nin NMPilasyonuna ilişkin kanıt sağlayamadı; bu da NiRAN alanı kendi kendine NMPilasyonunun (en iyi ihtimalle) ikincil bir aktivite olduğunu öne sürüyor.Bununla birlikte, diğer çalışmaların, bakteriyel NMPilatörün kendi kendine AMPilasyon durumunun, diğer protein substratları üzerindeki NMPilasyon aktivitesini kontrol edebildiğine dair ön kanıtlar sağladığına dikkat edilmelidir (22, 33).Bu nedenle, EAV nsp9 (16) ve koronavirüs nsp12 (bu çalışma) için bildirilen kendi kendine NMPilasyon aktivitelerinin, C-terminal RdRp alanının katlanması üzerinde önerilen şaperon benzeri etki de dahil olmak üzere olası fonksiyonel etkilerini araştırmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır (1). 16) ).

Daha önce, RNA ligaz, RNA başlıklı guanilat transferaz ve protein hazırlama aktivitesi (16) dahil olmak üzere nidoviral NiRAN alanının olası aşağı akış fonksiyonlarına ilişkin çeşitli hipotezler düşünülmüştü, ancak bunların hiçbiri mevcut aşağı akış fonksiyonlarıyla uyumlu değildi.Aşağıdaki konumlarda elde edilen bilgiler, ek varsayımlar yapılmadan tam olarak aynı andadır.Bu çalışmada elde edilen veriler, NiRAN alanının protein kaynaklı RNA sentezinin başlatılmasında rol oynadığı ile son derece tutarlıdır (ancak bunu kanıtlayamaz).Daha önce NiRAN alanının 5a?'daki fonksiyonunun olduğuna inanılıyordu.²-RNA kapatma veya RNA ligasyonu reaksiyonları bunlardan etkilenmez ve diğer verileri destekler.Bu nedenle, örneğin, NiRAN'ın aktif bölgesinin genel bir baz olarak korunmuş Asp'yi içerdiği düşünülmektedir (Pseudomonas syringae SelO'da D252; HCoV-229E pp1ab'da D4271; SARS-CoV-2 nsp12'de D208) (SI Ek, şekil 2) ).S2) (17, 22, 33), ATP'ye bağımlı RNA ligaz ve RNA başlık enzimindeki kataliz, Değişmemiş bir Lys kalıntısı içeren kovalent enzim-(lisil-N)-NMP ara maddesi tarafından gerçekleştirilir ( 41).Ek olarak, koronavirüs NiRAN'ın korunmuş protein hedefleri için dikkate değer dizi bazlı özgüllüğü ve NTP ortak substratları (UTP'yi tercih eder) için gevşetilmiş özgüllüğü, NiRAN aracılı kapatma enzimi veya RNA ligaz benzeri fonksiyonlara karşı çıkar.

Açıkça görülüyor ki, nsp9-UMP'nin (nsp9-NMP) protein kaynaklı RNA sentezindeki olası rolünü doğrulamak ve eğer kanıtlanırsa, bu rolü detaylandırmak için çok fazla ekstra çalışmaya ihtiyaç vardır; bu, daha önce bildirilen birkaç ilginç ancak (şimdiye kadar) raporu birbirine bağlayacaktır. .İzole gözlemler.Örneğin, koronavirüsün negatif iplikçikli RNA'sının sonunun bir oligo(U) iplikçik ile başladığı belirlenmiştir (42, 43).Bu gözlem, negatif iplikçikli RNA sentezinin, nsp9'un UMPillenmiş formunun poli(A) kuyruğuna (tetikleyiciler) bağlanmasıyla başlatıldığı fikriyle tutarlıdır; bu, RNA bağlanmasıyla desteklenebilir. başka bir RTC proteini.Nsp9 tarafından sağlanan UMP kısmı daha sonra genomik RNA'daki 3??²-poli(A) kuyruğu veya başka bir oligo (A) içeren dizi kullanılarak nsp7/8/nsp12 aracılı oligouridilasyon için bir "primer" olarak kullanılabilir. picornavirüs VPg proteini için oluşturulan mekanizmaya benzer şekilde bir şablon görevi görür (44).Teklif "normatif değilse" ne olur????(Protein kaynaklı) negatif iplikçikli RNA sentezinin başlatılması, gözlemlerle bir bağlantı sağlar ve bu da koronavirüs negatif iplikli RNA'nın ucunda (42) UMP'nin (UTP yerine) bulunduğunu gösterir. Dicer nükleik asidi, bilinmeyen bir üridin spesifik endonükleaz tarafından fosforile edilen ucu böler.Doğrulanırsa, bu nükleik asit hidrolitik aktivitesi, nsp9'un oligomerik UMPillenmiş formunun, yeni oluşan negatif ipliğin 5 ² ucundan salınmasına yardımcı olabilir.Nsp9'un protein hazırlamadaki olası rolü, nsp9'un (ve nsp8'in) koronavirüs genomunun 3 ucuna yakın korunmuş cis-etkili RNA elemanı ile kritik ve spesifik olarak etkileşime girdiğini gösteren önceki ters genetik çalışmaları ile de tutarlıdır.45).Bu rapora göre, bu önceki gözlemler artık yeniden incelenebilir ve daha ileri araştırmalarla genişletilebilir.

Özetle, verilerimiz N terminalinde RdRp'ye bağlı tescilli bir yuvalanmış virüs enzim etiketinin spesifik aktivitesini belirledi.Coronavirüste, yeni keşfedilen bu NiRAN aracılı UMPilatör/NMPilatör aktivitesi, Mn2+ ve bitişik Asn kalıntılarına güvenmek ve N-terminal birincil amin ile (düşük enerjili) fosforamidat bağlarının oluşumuna neden olmak için kullanılır.Nsp8|9 bölünme bölgesindeki Mpro aracılı bölünme yoluyla, nsp9 hedefi NMPilasyon için kullanılabilir; bu, proteaz ile RdRp'ye uzanan NiRAN alanı arasındaki fonksiyonel eşleşmeyi gösterir.Nsp12 NiRAN aktif bölgesindeki ve nsp9 hedefindeki önemli kalıntıların korunması, SARS-CoV-2 dahil iki koronavirüsten elde edilen verilerle birleştirildiğinde, nsp9 NMPilasyonunun bir koronavirüs olduğuna dair güçlü kanıtlar sağlar. Muhafazakar özellikler aynı zamanda virüs replikasyonunda da önemli bir adımdır.Mevcut veriler bizi, protein kaynaklı RNA sentezinde NMPile edilmiş nsp9 formunun spesifik rolünün, koronavirüs ve diğer yuvalanmış virüsler için makul bir senaryo olduğu ve NiRAN'ın diğer tanımlanamayan proteinleri de hedefleyebileceği sonucuna varmamıza yol açıyor.Virüsü düzenleyin.Ev sahibi etkileşimi.Doğrulanırsa, protein primerlerinin viral RNA sentezine dahil edilmesi, daha önce tespit edilen koronavirüs ve pikornavirüs benzeri süper grup (9) arasındaki Mpro/3CLpro ve RdRp alanlarının sekans afinitesini artıracaktır; bu grup, yeni oluşturulan Pisoniviritler'de artık birleştirilmiştir (9). 46) kategorisinde.

Verilerimiz ayrıca bu çalışmada tanımlanan temel, seçici ve konservatif enzim aktivitelerinin antiviral ilaçlar için hedef olarak kullanılabileceğini göstermektedir.NiRAN'ın aktif bölgesindeki korunmuş nsp9 N-terminalinin bağlanmasına (ve ardından modifikasyonuna) müdahale eden bileşikler, farklı (alt)cins Enfeksiyonlardan hayvan ve insan koronavirüslerinin tedavisine uygun, etkili ve çok yönlü antiviral ilaçlar halinde geliştirilebilir. SARS-CoV-2 ve Orta Doğu Solunum Sendromu Coronavirüsü dahil.

Bu çalışmada üretilen koronavirüs proteininin kodlama dizisi, HCoV-229E ile enfekte Huh-7 veya SARS-CoV-2 ile enfekte Vero E6'dan izole edilen ve standart klonlama prosedürleri kullanılarak yerleştirilen RNA kullanılarak RT-PCR ile çoğaltıldı.pMAL-c2 (New England Biyoloji Laboratuvarı) veya pASK3-Ub-CHis6 (47) ekspresyon vektörü (SI Ek, Tablolar S1 ve S2).Tek kodon ikameleri, PCR bazlı bölgeye yönelik mutajenez yoluyla gerçekleştirildi (48).MBP füzyon proteinini üretmek için E. coli TB1 hücreleri, uygun pMAL-c2 plazmit yapısı (SI ek, Tablo S1) ile dönüştürüldü.Füzyon proteini, amiloz afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve faktör Xa ile bölündü.Daha sonra C-terminali His6 etiketli protein, daha önce açıklandığı gibi (49) Ni-hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi (Ni-IMAC) ile saflaştırıldı.Ubikuitin füzyon proteinini üretmek için E. coli TB1 hücreleri, uygun pASK3-Ub-CHis6 plazmid yapısını (SI Ek, Tablolar S1 ve S2) ve ubikuitine özgü C-terminal hidrolaz 1'i (Ubp1) kodlayan pCGI plazmit DNA'sını kullandı.Dönüşüm (47).C-terminali His6 etiketli koronavirüs proteini, daha önce açıklandığı gibi saflaştırıldı (50).

HCoV-229E nsp12-His6'nın kendi kendine NMPilasyon testi, EAV nsp9'da (16) anlatıldığı gibi gerçekleştirildi.Kısacası, nsp12-His6 (0,5 µM), 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiyotreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM tampon içerir, inkübe edin belirtilen NTP ve 0,17 µM, 30 dakika boyunca 30 °C'de [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ile eşleşti.Nsp12 aracılı nsp9 NMPilasyonunun diğer tüm (standart) NMPilasyon analizlerinde reaksiyon koşulları şu şekilde ayarlanır: 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) varlığında nsp12-His6 (0,05 uM) ve nsp9-His6 (4 uM) ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 uM, NTP'yi gösterdi ve 0,17 uM, [a32-P]NTP ile eşleşti.30°C'de 10 dakika inkübe edildikten sonra reaksiyon numunesi, SDS-PAGE numune tamponu ile karıştırıldı: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometan HC1 (pH 6,8), 100 mM DTT, %2,5 SDS, %10 gliserol ve %0,005 bromofenol mavi.Protein, 90°C'de 5 dakika ısıtılarak denatüre edildi ve %12 SDS-PAGE ile ayrıldı.Jel sabitlenir ve Coomassie Brilliant Blue çözeltisi (%40 metanol, %10 asetik asit, %0,05 Coomassie Brilliant Blue R-250) ile boyanır, rengi giderilir ve 20 saat boyunca fosforlu bir görüntüleme ekranına maruz bırakılır (NMPilasyondan nsp12'yi tespit etmek için) veya (maksimum) 2 Saat (nsp9 NMPilasyonunu değerlendirmek için).Ekranı taramak için bir Typhoon 9200 görüntüleyici (GE Healthcare) kullanıldı ve sinyal yoğunluğunu analiz etmek için ImageJ kullanıldı.

MS analizi için, NMPilasyon analizinde (SI ek, Tablo S1) 1 uM nsp12-His6 ve 10 uM nsp9 (heksahistidin etiketi olmadan) kullanıldı ve 500 uM UTP ve GTP'nin artırılmış konsantrasyonu kullanıldı.Konsantrasyonlarına ve beklenen protein kalitesine bağlı olarak, MassPrep kolonu (Waters) ile donatılmış bir Waters ACQUITY H-Sınıfı HPLC sistemi, 1 ila 10 µL tamponlu protein solüsyonunun tuzunu çevrimiçi olarak tuzdan arındırmak için kullanıldı.Tuzdan arındırılmış protein, aşağıdaki tampon A (su/%0,05 formik asit) ve tampon B (asetonitril/%0,045 formik asit) gradyanı yoluyla Synapt G2Si kütle spektrometresinin (Waters) elektrosprey iyon kaynağına elüte edilir ve kolon sıcaklığı: 60 °C ve 0,1 mL/dakika akış hızı: 2 dakika boyunca %5 A ile izokratik olarak elüsyon, ardından 8 dakika içinde %95 B'ye doğrusal bir gradyan ve %95 B'yi 4 dakika daha koruyun.

Kütle aralığı 500 ila 5000 m/z olan pozitif iyonlar tespit edilir.Glu-fibrinopeptid B, otomatik kütle kaymasının düzeltilmesi için her 45 saniyede bir ölçülür.Taban çizgisini çıkardıktan ve yumuşattıktan sonra ortalama spektrumun evrişimini açmak için MaxEnt1 uzantılı MassLynx cihaz yazılımını kullanın.

UMPillenmiş HCoV-229E nsp9, sekanslama derecesinde modifiye edilmiş trypsin (Serva) eklenerek sindirildi ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edildi.Peptitlerin tuzunu gidermek ve konsantre etmek için bir Chromabond C18WP döndürme kolonu (parça numarası 730522; Macherey-Nagel) kullanıldı.Son olarak peptit, %5 asetonitril ve %0,1 formik asit içeren 25 uL su içerisinde çözüldü.

Numuneler, bir Orbitrap Velos Pro kütle spektrometresi (Thermo Scientific) kullanılarak MS ile analiz edildi.Özel uca monteli 50 cm'lik bir uç ile donatılmış üstün nanoâ HPLC sistemi (Dionex)2,4 μm manyetik boncuklarla paketlenmiş 75 μm C18 RP kolonu (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray kaynağı aracılığıyla kütle spektrometresine çevrimiçi olarak bağlanın;300 μm'lik bir iç çapa 6 μL trypsin sindirim çözeltisi enjekte edin ×??1 cm C18 PepMap ön konsantrasyon kolonu (Thermo Scientific).Çözücü olarak su/%0,05 formik asit kullanılarak numune otomatik olarak tutuldu ve 6 µL/dakika akış hızında tuzdan arındırıldı.

Aşağıdaki su/%0,05 formik asit (çözücü A) ve %80 asetonitril/%0,045 formik asit (çözücü B) gradyanları, 300 nL/dakika akış hızında triptik peptitlerin ayrılmasını sağlamak için kullanıldı: %4 B, 5 dakika, ardından dakikalar içinde %45 B'ye 30 A doğrusal gradyan ve 5 dakika içinde %95 çözücü B'ye doğrusal bir artış.Kromatografik sütunu paslanmaz çelik bir nano yayıcıya (Proxeon) bağlayın ve eluent'i 2.300 V'luk bir potansiyel kullanarak doğrudan kütle spektrometresinin ısıtılmış kılcal damarına püskürtün. Orbitrap kütle analiz cihazında 60.000 çözünürlükte anket taraması ilişkilidir. En az üç veri MS/MS taramasıyla, doğrusal iyon tuzağı çarpışmasıyla indüklenen ayrışma veya yörünge tuzağı tespiti ile birleştirilmiş daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması kullanılarak 30 saniye boyunca dinamik olarak hariç tutulur. Çözünürlük 7.500'dür.


Gönderim zamanı: Ağu-03-2021